近日，我组联合国家蛋白质科学中心（北京）贺福初/常乘团队，开发蛋白沉淀−固相萃取（PP−SPE）一体化全溶液前处理新策略，攻克人血清自上而下（Top-down）蛋白质组动态范围悬殊、低分子量蛋白变体回收率低的技术瓶颈，实现人血清蛋白变体规模化深度鉴定。
自上而下蛋白质组学能够直接表征完整蛋白质变体，将遗传变异、RNA选择性剪接和翻译后修饰与疾病表型直接关联。然而，人血清中蛋白质丰度的极端动态范围（超过10个数量级）及高丰度蛋白的掩蔽效应，使得低分子量蛋白质变体的深度鉴定面临巨大挑战，传统凝胶基方法（如PEPPI，Passively Eluting Proteins from Polyacrylamide gels as Intact species）操作繁琐、难以自动化，限制了其在临床队列中的应用。
在本工作中，研究团队首先系统比较了HLB、C18及硅胶三种SPE色谱填料。HLB凭借亲水-亲脂平衡的双重保留机制，单次运行平均鉴定1,062种蛋白质变体（对应125种蛋白），技术重复相关系数R达0.93，显著优于C18和硅胶，为后续沉淀条件优化奠定了材料基础。之后选取硫酸铵、氯化钠、甲醇、丙酮、乙腈五种沉淀剂，在10%、30%、50%三个浓度水平进行正交评估。从所有沉淀上清中共鉴定出4,470个非冗余蛋白质变体，对应480种蛋白，覆盖度较已有最大数据集提升约20%。不同沉淀剂展现出正交的分子筛效应：AS以尺寸/疏水性选择为主，NaCl受电荷屏蔽驱动，有机溶剂则通过降低介电常数去除疏水性变体。
与经典凝胶基PEPPI方法头对头比较，PP-SPE在蛋白质变体的鉴定深度上提升约5倍（1,062 vs. 200），尤其在<5 kDa低分子量区域，鉴定数量提升十倍以上（占比88.3% vs. 26.3%），同时保持高鉴定置信度（中位E-value ≤ 10-5）。PP-SPE全流程仅需4-5小时，较PEPPI缩短约40%，且完全基于溶液操作，易于适配96孔板及自动化平台，为大规模临床研究提供了高效、稳健的前端工具。
本研究构建了目前最全面的人血清自上而下蛋白质组数据集之一，与2025 HUPO人类蛋白质组计划参考数据集[1]对比，PP-SPE鉴定蛋白中PE1级注释占比高，且富集了更多含信号肽的分泌蛋白，符合血清蛋白质组特征。该方法未来有望整合自动化液体处理系统，推动蛋白质变体在疾病标志物发现与精准医学中的应用。
研究成果以“Integrated Protein Precipitation–Solid-Phase Extraction Workflow for Deep Top-Down Proteomic Analysis of Human Serum”为题发表于Journal of Proteome Research。质谱数据已上传至iProX数据库公开（PXD073228）。安徽医科大学与国家蛋白质科学中心（北京）联合培养研究生刘宁、东北大学和大连化物所联合培养研究生张蒙为共同一作，常乘博士和刘哲益博士为共同通讯作者。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等课题资助；研究依托大连相干光源生物质谱平台完成数据采集，大连医科大学附属二院为本研究提供合规临床血清样本。（文/图 刘宁）
参考文献
[1] Deutsch E W, Lindskog C, Budnik B, et al. The 2025 Report on the Human Proteome from the HUPO Human Proteome Project [J]. J Proteome Res, 2026,25(2): 539-555.
